Protocolos de prácticas de laboratorio

SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

MATERIALES
• Mortero.
• Tijeras.
• Espinacas u hojas verdes.
• Embudo con papel de filtro.
• Tubo de ensayo en gradilla.
• Éter etílico. • Alcohol metílico puro (cuidado, sus vapores son muy tóxicos).
• Cápsula de Petri o vaso de precipitados.
• Capilar o micropipeta (cuentagotas en su defecto).
• Tira de papel cromatográfico Wathman (con un buen papel de filtro se obtienen, incluso, mejores resultados).
INTRODUCCIÓN
Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones.
FUNDAMENTO
Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por capilaridad a través de una tira de papel poroso (papel de cromatografía o de filtro) dispuesta verticalmente sobre una película de un disolvente orgánico (etanol), ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al disolvente a medida que éste asciende. Las menos solubles avanzarán menos en la tira de papel de filtro.
Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más, dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la disolución alcohólica según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.
TÉCNICA
1. Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas, quitando las nerviaciones más gruesas, junto con 10 o 15 cc de éter etílico.
2. Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa (utilizar campana de gases a lo largo de toda la práctica).
3. Filtrar en un embudo con papel de filtro y recoger en un tubo de ensayo (es suficiente con 2 o 3 cc. de solución de pigmentos).
4. Colocar en la tapadera de una caja de Petri metanol absoluto hasta una altura de 0,5 a 1 cm.
5. Cortar una tira de papel de filtro de unos 8 cms. de anchura y unos 10 a 15 cms. de altura.
6. Poner con el capilar en el papel de cromatografía entre 5 y 10 gotas de solución de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secándose el éter etílico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrán siempre en el mismo punto (se puede marcar con un lápiz), situado a nos 2 cm por encima del borde inferior del papel.
7. Doblar el papel cromatográfico a lo largo y colocarlo en la placa de petri con la mancha de pigmento a 1 cm. de la superficie del eluyente. Podemos sustituir la placa de petri por un vaso de precipitados y fijar el papel cromatográfico con una pinza a un soporte horizontal colocado en el borde del vaso (por ejemplo, una varilla de vidrio).
8. Esperar unos 30 minutos y observar.
CUESTIONES Y RESULTADOS
1. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos, clorofila a, clorofila b y xantofila. Indicar qué pigmento corresponde a cada banda.
2. ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?
3. ¿Qué pigmentos son los más abundantes?
4. Por encima de las clorofilas aparece más de una banda, ¿qué significado tiene?
Práctica en formato Word 2003: pigmentos.zip (24Kb)


Reconocimiento de lípidos
________________________________________
MATERIALES
• Tubos de ensayo
• Gradilla
• Varillas de vidrio
• Mechero
• Vasos de precipitados
• Pipetas • Solución de NaOH al 20%
• Solución de Sudán III
• Tinta china roja
• Eter, cloroformo o acetona
• Aceite de oliva
1. SAPONIFICACIÓN
FUNDAMENTO
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina.
TÉCNICA
. Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%.
. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.
. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado.

2. TINCIÓN
FUNDAMENTO
Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III.
TÉCNICA
1. Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite.
2. Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III.
3. Al otro tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja.
4. Agitar ambos tubos y dejar reposar.
5. Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará teñido.
3. SOLUBILIDAD
FUNDAMENTO
Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sitúa sobre el agua.
Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc.
TÉCNICA
1. Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo.
2. Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de éter u otro disolvente orgánico,
3. Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
4. Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y, en cambio no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad.
CUESTIONES
1. ¿Qué son los jabones?
2. ¿Cómo se pueden obtener los jabones?
3. ¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa?
4. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas?
5. Indica lo que ocurre con la mezcla aceite-Sudán III y aceite-tinta y explica a qué se debe la diferencia entre ambos resultados.
6. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos minutos de reposo?¿Y con la de benceno y aceite?¿A qué se deben las diferencias observadas entre ambas emulsiones?
Observación de bacterias
________________________________________
OBJETIVOS
1. Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales.
2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qué casos se recomienda una u otra.
3. Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen.
4. Practicar con el microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersión.
MATERIAL
• Mechero Bunsen o de alcohol
• Asa de siembra o aguja enmangada
• Pinzas
• Portaobjetos
• Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc. • Colorantes para tinción:
a) Solución de cristal violeta al 1%
b) Solución de safranina al 0,5%
c) Azul de metileno al 1%
• Microscopio y aceite de inmersión

BACTERIAS DEL YOGUR
El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30µm de longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio.
1. Realizar el frotis disolviendo una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teñir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
4. Observar al máximo aumento del microscopio.
BACTERIAS DEL VINAGRE
El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti, aunque también Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares.
1. Tomar con una aguja enmangada una pequeña porción de madre de vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado.
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis.
3. Dejar secar y fijar con calor.
4. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.
BACTERIAS DEL SARRO DENTAL
El sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Está constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metabólicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparación, pero suelen abundar bacterias saprófitas, pudiéndose observar gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.
1. Con una aguja enmangada tomar una pequeña porción de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos.
2. Dejar secar y fijar con calor.
3. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.
BACTERIAS DEL SUELO
La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prácticamente infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso, desconocidas para los microbiólogos. Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardín. Después de varios días, las bacterias se habrán adherido al vidrio y sólo habrá que fijarlas por calor y teñirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, así como la parte que no se va a teñir.

Gemación de levaduras
________________________________________
MATERIAL
• Microscopio
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Levadura • Agua azucarada
• Aguja enmangada
• Lactofenol-safranina

TÉCNICA
1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada.
2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.
3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad:
o Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina.
o Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.
RESULTADOS
Las siguientes fotos han sido obtenidas a partir de preparaciones teñidas con azul de metileno y no con lactofenol-safranina.

Mitosis en células de raíz de cebolla
________________________________________
MATERIALES
• Microscopio
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Lanceta estéril
• Cubeta de tinción
• Aguja enmangada
• Pinzas
• Palillos • Frasco lavador
• Mechero de alcohol
• Tijeras
• Papel de filtro
• Vaso de precipitados
• Vidrio de reloj
• Orceína A
• Orceína B
TÉCNICA
1. Llenar un vaso de precipitados con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 o 4 cm de longitud.
2. Cortar con las tijeras unos 2-3 mm del extremos de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3 ml de orceína A.
3. Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición, hasta la emisión de vapores tenues.
4. Con las pinzas tomar uno de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de orceína B y dejar actuar durante 1 minuto.
5. Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unos golpecitos sobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida.
6. Sobre la preparación colocar unas tiras de papel de filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar sobre el papel de filtro en la zona del cubreobjetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale. Si la preparación está bien asentada no hay peligro de rotura por mucha presión que se realice.
7. Observar al microscopio.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA (foto x150 / x600)
Se realizará a fuertes aumentos. La orceína A reblandece las membranas celulares y la B completa el proceso de tinción. Con la presión sobre el porta de la preparación se logra una extensión y difusión de las células del meristemo de la cebolla.
La preparación presenta el aspecto de una dispersión de células por todo el campo que abarca el microscopio. Se observan células en diversas fases o estados de división celular. Se ven los cromosomas teñidos de morado por la orceína. El aspecto reticulado así como el mayor tamaño de algunos núcleos corresponde a las células que se encontraban en los procesos iniciales de la división mitótica. Ver secuencia completa